前言
在分析方法的开发过程中，当遇到响应差、极性高或无法分离的杂质时，衍生化分析方法往往是一个不错的选择。一般来说，带有氨基(R-NH3)、羧基(R-COOH)、醛基(R-CHO)、酮羰基(R-CO-R)、酯基(R-CO-OR)、酰基卤（带有R-CO-X等基团的有机化合物）可以衍生化。本文主要总结了衍生化分析方法的总体开发思路和一些注意事项。
01衍生化试剂的选择及添加量的确定
1) 衍生化试剂的选择
衍生化分析方法的发展很大程度上取决于化合物的结构，需要根据化合物官能团、检测器、灵敏度、特异性等因素综合选择衍生化试剂。我在《杂质反应差、极性高、无法分离？》中写道。 《了解柱前衍生化方法》一文列出了最常见官能团的衍生化案例。有兴趣的同事可以在报名圈查看，作为参考。
衍生化试剂通常的选择原则是：易于获得、与待测组分快速反应、满足灵敏度要求的衍生产物、副反应少+反应位点少（即选择性高，通常反应位点越多，衍生化试剂越多）。副产物较多），衍生化试剂不干扰衍生产物的检测，副反应产物不干扰待测衍生产物的检测。它们对色谱柱和精密仪器的损害很小（如果有损害，如酰氯，则需要猝灭反应），且低毒或无毒。 、环保等。 常见衍生化试剂：硅烷烃、苯肼、酰基卤、手性衍生化试剂（如α、脯氨酸等）很常见且容易获得。
2）添加量的确定
衍生化反应需要结合反应机理计算衍生化试剂的摩尔比浓度。如果主成分也将被衍生化，则衍生化试剂的浓度将被转换为主成分。如果主成分不进行衍生化，则将衍生化试剂的浓度换算成杂质浓度来计算衍生化。所需最小试剂量，在此基础上，可根据反应条件灵活设计浓度和添加量。检查添加量时，建议将配制好的加标溶液按照回收率验证的上限浓度进行加标，如150%或200%，以保证衍生化试剂的添加量能够满足高浓度方法验证的要求。
02推导方法的选择
样品的衍生化方法主要分为柱前衍生化和柱后衍生化。柱前衍生又分为在线衍生（即程序进样）和离线衍生。柱后衍生化通常是在线衍生化。下表列出了三种衍生方法的优缺点。一般来说，程序进样和柱后衍生化比较方便，但局限性较多；柱前离线衍生化的局限性较少，方法开发效率较低。适用范围较广，但操作较复杂；柱后衍生化更具特异性。必须根据衍生反应的特点来选择衍生方法。
微分法
预柱 - 程序进样
介绍
程序进样采用精密仪器（HPLC、UPLC、GC）的程序进样设置，利用仪器自动吸取一定体积的样品、衍生化试剂（固定进样位）、催化剂（固定进样位），并保持在线。衍生化反应在短时间内进行（HPLC主要在定量回路中反应，GC在进样针中），转化为衍生化产物，然后通过色谱柱自动进样进行分离检测。
优势
效率高，重复性好，简化实验操作，减少工作量，减少人为干扰因素。
缺点
衍生化试剂、反应溶剂、衍生化条件的选择有很大的局限性，不适合需要高温加热的衍生化反应；衍生化反应要求快速；软件操作比较复杂，有特定的检测设备（HPLC、GC等）和软件要求。优化色谱条件比柱后衍生化更复杂。
例子
吴海志,肖月慧子,朱丽等,程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法测定乳制品中牛磺酸含量[J].食品研究与开发，2021 年 11 月，第 42 卷，第 21 期，116-120。
微分法
柱前线下衍生品
介绍
离线衍生化反应由人工进行，转化为衍生化产物，直接进样或经过一定的样品后处理后进样，然后通过色谱柱分离检测或直接由其他检测设备（如紫外可见分光光度计）检测）。光度计）。
优势
它的应用范围很广，对衍生化试剂和衍生化时间有广泛的要求，并且没有特定的检测设备要求。可对衍生化副产物进行预处理。
缺点
工作量大，实验设计时需要考虑人的操作差异。
例子
2020年版《中国药典》第二部正文中复方氨基酸注射液（18AA-Ⅲ）的含量测定
微分法
柱后衍生化
介绍
首先利用色谱柱分离化合物，然后利用柱后衍生反应对分析物进行分析，并与相应的试剂发生反应。生成的衍生产物随后进入检测器进行检测。
目前常见的方法是在色谱柱后安装反应管（可以自行开发或购买一些合适的市售柱后衍生柱/包）；二是安装专门的柱后衍生系统。
优势
效率高、特异性强，简化实验操作，减少工作量，减少人为干扰因素，不改变样品溶液中化合物的分离和保留行为，相对更容易追踪杂质。
缺点
衍生化试剂和反应溶剂的选择存在很大的局限性。带有反应管的柱后衍生法不适合需要高温加热的衍生反应。有检测设备要求（HPLC），需要快速衍生化反应，可能会造成样品扩散问题；由于在线反应环境是流动相，必须适应衍生化反应，这可能会对流动相体系的选择造成一定的限制。或者可能需要开发专门的柱后衍生化系统，这会增加研发成本。
例子
反应管安装：食品安全国家标准，婴幼儿食品和乳制品中维生素K1的测定，柱后接锌还原柱进行衍生化反应。
柱后衍生化系统：张莉，朱舒等，高效液相柱后衍生化方法测定食品中黄曲霉毒素B1，2006年16月70日。
03 反应溶剂和样品稀释剂/萃取猝灭剂的选择
1) 反应溶剂
衍生反应溶剂用于衍生反应。反应溶剂主要分为以下四种情况，主要根据衍生化机理、化合物溶解度、色谱体系等进行选择。例如，烷基化或酰化反应必须在非质子溶剂中进行，并且需要根据样品的溶解度来选择反应溶剂/样品溶剂。
非质子非极性溶剂
甲苯、乙醚、四氯化碳、正己烷等
非质子极性溶剂
乙腈、DMF、DMSO、二氯仿、丙酮等
质子溶剂
含有-OH、-NH2等，如甲醇、水、异丙醇等。
衍生化试剂本身
衍生化试剂本身是液体，如苯甲醛、异硫氰酸苯酯等，其本质上通常是质子溶剂，即具有较强的反应活性。
反应溶剂的选择原则上应不与衍生化试剂和分析物发生反应（衍生化试剂本身作为溶剂除外），能够溶解分析物和衍生化试剂，且不干扰分析物的色谱检测。衍生产品；如果要进入精密仪器系统，对色谱柱和精密仪器损伤小，与流程混溶；低毒或无毒，环保。
2) 稀释剂/萃取剂
稀释剂用于检测系统。主要结合色谱检测系统和衍生产品溶解度选择。稀释剂和试剂可以相同或不同，其主要作用是提取样品或稀释样品。稀释剂的主要原则是必须能溶解衍生化产物，对色谱柱和精密仪器损伤小，低毒或无毒，对环境友好。
猝灭剂服务于衍生化反应，猝灭剂和稀释剂可以相同或不同。如果猝灭剂同时用作稀释剂，则必须满足稀释剂的要求。
稀释具有强烈气味或可能腐蚀精密仪器的反应性溶剂。
例如，衍生化反应需要非质子溶剂环境（二氯甲烷、乙醚等）。二氯甲烷、乙醚等溶剂可能有强烈气味，或可能腐蚀反相精密仪器的管道。只要满足溶解度，最好用乙腈、醇（甲醇、乙醇、异丙醇等）、水等代替稀释剂，这样可以稀释反应溶剂，减少进入反应器的量精密仪器。
萃取衍生物
例如，如果衍生化反应在水相中进行，但检测系统是GC直接进样或正相HPLC，则需要用与水不混溶但溶解衍生产物的溶剂萃取衍生产物。
解决溶剂效应
例如，如果采用甲醇作为反应溶剂，进样分析时发现溶剂效应严重，可以将稀释剂更换为水或一定比例的甲醇-水混合溶液。
萃取反应
一些总是难以到达反应平台的衍生反应通常通过去除或消耗过量的衍生试剂或中和反应催化剂来停止。例如酸催化加碱中和催化剂、加水或醇消耗过量的酰基氯衍生剂、用正己烷从水相中萃取大部分异硫氰酸苯酯等。
04催化剂的选择及用量
催化剂服务于衍生化反应，这在很大程度上取决于衍生化反应机理。常见的衍生反应条件包括室温直接反应、酸性或碱性条件、加热、光催化、氧化、还原等。酸性条件如盐酸溶液、醋酸溶液，碱性条件如三乙胺、二乙胺、碳酸氢钠溶液、选择催化剂的原则是容易获得。根据衍生反应速率和反应副产物的量选择合适活性的催化剂。如果反应缓慢，请选择较强的酸或碱。如果反应体系副反应过多，则选择较弱的酸或碱。然而，催化剂浓度不会降解衍生试剂和分析物。
大多数催化剂被回收参与反应。催化剂的用量一般不宜过多。可根据反应速率和体系副反应来选择。然而，有些反应也需要考虑：除了催化反应之外，催化剂还可能具有其他功能。例如，三乙胺作为催化剂不仅催化反应本身，而且还充当酸结合剂。这部分的消耗是需要考虑的。另外，如果主成分含有反式盐，还需要考虑反式盐对催化剂的消耗。例如盐酸盐、三氟乙酸盐等会消耗碱性催化剂，因此催化剂的用量需要根据摩尔浓度换算成中和的反式盐酸盐的量。更简单的方法是直接测量反应溶液。酸碱度。
05 衍生反应进料顺序
衍生化反应的进料顺序也必须根据反应机理进行设计。不同的进料顺序可能会产生不同的最终产物或不同程度的副反应。一般来说，喂养分为以下四种情况需要注意。如果对反应机理没有特殊要求，可以随意选择加料顺序：
样品+衍生化试剂
在这种方法中，衍生化试剂通常非常活跃，可以快速衍生化样品，通常不需要催化剂。例如，酰基氯用作衍生化试剂，可衍生化醇、羧酸、醛、酮等。
样品+催化剂及衍生化试剂混合液+其他催化条件
该方法减少了溶液制备的工作量，但必须满足衍生化试剂本身在催化剂条件下不发生反应或降解。例如，两分子醛在稀碱条件下会自行反应缩合，因此在使用醛作为衍生化试剂时，不宜将醛与催化剂预先混合。一起。
样品溶液+催化剂+衍生化试剂+其他催化条件
这种方法制备溶液比较麻烦，而且主要关心的是反应特异性。某些反应的不同进料顺序会导致最终产物不同，如下图所示。
样品溶液+衍生化试剂+催化剂+其他反应条件
这种加料方法适用于待测物质在催化剂作用下自行反应的情况。例如，烯烃在酸性条件下自身会发生缩合反应。这种情况下，需要先将样品与衍生化试剂混合，以提高反应的特异性。首先，添加催化剂/其他催化条件。
06衍生化反应时间的研究
对于许多有机反应来说，达到100%反应终点的概率极低，因此只要衍生化反应达到平台期或采用某种手段终止萃取即可终止衍生化反应时间。配置衍生化的加标溶液（加标量最好覆盖回收率验证的最高点，如限度的150%或200%），并在适当的温度控制条件（如40℃）下等待衍生反应到达平台。 °C 或室温）。
07 衍生化反应温度选择
建议衍生反应温度不要太高，室温~60℃。如果反应在室温下进行，最好详细记录每次衍生化实验的环境温度。为了可控性和详细的可操作性，建议指定反应温度。温度不宜太高。温度过高容易造成化合物的降解或挥发，不安全。为了便于体积测定，反应容器通常选择量瓶。当反应容器为量瓶时，温度不应超过60℃。温度选择的原则是：不会因化合物降解或分析物挥发或过多的副反应而造成过度干扰，反应会快速进行。
08样品后处理
此项仅适用于离线预小节推导。
为了保护色谱柱，建议对衍生化反应液进行过滤，并进行过滤和吸附考察。建议检查空白溶液、敏感性溶液、对照品溶液和供试品溶液。对于过滤和吸附检查，同仁们应该很熟悉，这里不再赘述。
如果反应体系过于复杂，可以考虑对反应液进行后处理，如超滤去除较大分子量干扰、固相萃取、过柱等。
09计算方法选择
计算分析物含量的常用方法有两种：①反应转化率很高，衍生产物容易获得。可将衍生产品作为对照品进行校准，配置外标对照品溶液，按外标法进行计算； ②反应转化率如果不高，则将被测物质作为对照品进行校准，配制对照品溶液，与供试品平行衍生化，用衍生化后的对照品溶液采用外标法计算。
10种色谱条件
色谱条件与有关物质常规分析方法相同，此处不再赘述。衍生化反应体系通常比较复杂，干扰较多，色谱条件需要与衍生化试剂、催化剂等配合开发。如果衍生化试剂或催化剂引入过多杂质，应更换更高纯度或等级的试剂。如果衍生化试剂或其他杂质始终干扰衍生化产物的检测，请考虑更换衍生化试剂，直至满足特异性。
柱后衍生化需要注意流动相的类型、流速等，需要考虑为衍生化反应留出足够的时间，而不会造成太严重的扩散。
11方法学验证
衍生化分析方法的验证也遵循ICH Q2 Q2(R1): of Text和《中国药典2020年版》的四项指导原则，此处不再赘述。只是有几点需要注意。
特异性验证
进行常规特异性与强降解实验相结合。如果衍生化分析方法特异性很强，可以结合强降解进行验证；如果分析方法特异性不够强，则不能选择强降解方法，并结合稳定期结束时的样品、影响因素30天样品、GLP批次子样品、代表性工艺样品等进行了验证。注意导数峰的纯度、相邻峰的分离以及光谱吸收模式。
LOQ验证方案设计
衍生化分析方法的LOQ除了包括化合物本身的LOQ浓度外，还包括衍生化方法的灵敏度。我见过同事直接用稀释衍生化的STD溶液来配制LOQ验证溶液，或者直接称量衍生产品对照品。我个人认为这是一种不合理的做法。这两种方法本质上都是稀释背景，并且没有考察分析方法的衍生能力的检测灵敏度。最合理的验证方法是按 LOQ 浓度制备分析物用于衍生化后检测。如果LOQ溶液的SN远大于10，则分析方法操作SOP中的灵敏度溶液可设计为“衍生化后STD稀释”或“用衍生化产品对照品制备”，但如果SN接近于10 10、灵敏度溶液设计应与样品一致，对照品采用同步衍生法制备。
线性解设计
衍生化方法的线性验证基本上是同时考察衍生反应的线性度和衍生产物本身的线性度。因此，合理的线性验证方法应该是制备各线性浓度的分析物溶液，用所提出的分析方法进行衍生化，然后进样进行分析。我见过一位同事配制高浓度储备液，并按照提出的分析方法进行衍生化，将溶液按不同比例稀释，然后注入样品进行分析，验证线性。这是一个技巧，不严谨、不科学，我个人并不推荐。这仅证明衍生产物本身具有良好的线性，但并不能证明衍生反应在基质存在下是线性的。