自诞生以来，福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本因其存储时间长以及关联临床和多组学数据的能力而成为生物技术研究、药物发现和回顾性遗传研究的宝贵资源。但遗憾的是，FFPE样本目前很少用于单细胞研究，组学检测项目也相当有限。原因是FFPE处理导致样品中RNA的质量下降和片段化，因此很难准确评估转录本表达。为了突破这一障碍，经过不断优化和探索，10x今年率先推出了-RNA实验方案。其技术核心是利用探针杂交来锁定RNA的表达状态。对于FFPE样本来说，不仅可以实现单细胞水平的研究，还可以获得高灵敏度、特异度和可重复性的转录组数据，这意味着研究人员可以解锁生物库中存储的大量有价值的信息，这对于未来的翻译具有重要意义和临床研究。意义。本期我们将为您简单介绍FFPE样本单细胞测序的原理及其最新研究进展。

实验原理

在-RNA实验方案中使用的-RNA试剂盒中，针对目标mRNA设计了两个连续的特异性探针，涵盖人类基因和小鼠基因。探针对的数量是共同指定的。一般每个Gene包含3对探针，针对一些表达丰度特别高的基因设计1对探针。每个探针对中，LHS（左探针）包含read 2结构，RHS（右探针）包含read 2结构，还有1个（pCS1）结构，（共16种）用于区分样品来源，pCS1可以是与凝胶上的 10x 序列一起使用。探针杂交后，在探针连接之前，仅同时杂交目标mRNA的两个连续探针片段。如果只捕获一段，则后续建库将无法完成，有效减少误报。随后，mRNA 模板被完全降解，配对探针从细胞核中出来，并被单一油包水结构中包含 Gel、UMI 和 pCS1 序列的引物序列捕获。最终的探针序列用于文库构建和测序。 （如下图所示）。

初步结果

对于该方法，10x 团队使用 33 个人的 25μm-100μm FFPE 组织切片来测试单细胞 FFPE 测序。切片的保存年限为 1 至 19 年，其中 23 个样本产生了高质量的数据，但总体数据质量会因 FFPE 样本质量和组织年龄而异。一般来说，保存超过 10 年的组织不太可能产生高质量的数据。

随后，10x 团队还利用该方法对单个 FFPE 样本进行了研究。在今年的 AGBT 会议上，10x 团队向我们展示了使用浸润性导管癌的固定 FFPE 样本进行单细胞转录组测序的初步数据。实验产生了13种细胞类型（包括1种未知细胞类型），并且从FFPE样本中还检测到了多种免疫细胞。浸润性导管癌是乳腺癌最常见的病理类型，乳腺癌是一种具有多种病理类型的复杂疾病。每种肿瘤亚型都具有独特的特征以及显着的细胞和分子异质性。通过单细胞 FFPE 测序，所得基因特征可应用于数据集中的每个细胞簇。这种类型的分析以前只对新鲜样本进行过，但在 FFPE 样本的数据上找到它可以让研究人员将其应用于大量生物库 FFPE 样本，解锁更多存档样本。

浸润性导管癌 FFPE 组织的单细胞分析

通过标记基因的表达，还可以看到细胞增殖和T细胞耗尽的情况

将每个细胞簇与遗传特征相关联，只有一个细胞簇（编号为 17）实际上显示出与癌症亚型有很强的相关性，而其他细胞簇则与正常特征相关。

研究进展

最近，10x团队发表了一篇题为《High of the cell, and in situ of FFPE》的文章（

）文章中，研究团队利用导管癌的 FFPE 样本进行了更深入的研究。

单细胞 FFPE 解决方案 现有 3' 基因表达和 5' 基因表达解决方案的中值基因检测灵敏度为 10 倍

值得一提的是，为了进一步测试新型单细胞FFPE测序技术的性能，文章使用了一系列单细胞技术和新鲜样本进行对比。上述每种技术的定量灵敏度通过中值基因表达来表征。当不同平台的测序深度保持不变（每个细胞约10,000个）时，基于10x -RNA技术的单细胞FFPE解决方案的中位基因检测灵敏度高于10x现有的3'基因表达和5'基因表达。

单细胞 FFPE 测序和数据展示了 FFPE 组织空间背景下的完整转录组信息

此外，文章还演示了三种 FFPE 样品兼容的检测方法。其中，单细胞FFPE测序是唯一能够在单细胞分辨率下提供完整转录组数据的方法，这使得它非常适合建立疾病基线和注释细胞类型。设计或验证目标基因组合。与单细胞 FFPE 测序一样，还提供全转录组数据。由于两种技术使用相同的探针组，单细胞FFPE测序和数据的整合简单方便，为后续组学整合创造了有利条件。随着基础研究和分子生物学相关技术的不断发展，单细胞FFPE测序未来将与不同技术相结合，为我们解锁更丰富的生物信息，包括肿瘤微环境、细胞特异性、生物发育等。研究领域出现新变化。