一、原理

多聚酶链式反应，简称PCR，与DNA的自然复制机制相似：通过变性、退火、延伸等步骤的反复循环（如图1所示），DNA的扩增倍数能够达到2的n次方。也就是说，

Y = ( 1 + X ) n

在公式中，Y 代表DNA的扩增倍数，X 表示扩增的效率，n 则是循环的次数。

二、材料

模板DNA、PCR引物、Taq DNA聚合酶、、PCR缓冲液（含有20 mmol/L的Tris-Hcl缓冲液，pH值为5.3，1.5 mmol/L的，25 mmol/L的KCl，100 μg/mL的灭菌明胶或无核酸酶的牛血清白蛋白，以及0.05%的20倍浓缩液）；石蜡油。

（2）乙肝病毒基因的PCR 检测试剂盒

（3） PCR 扩增仪。

图1 PCR 基本原理示意图

三、方案

1 、经典的PCR 扩增方案

经典的PCR 扩增方案为：

反应总体积 100μL

模板DNA 105 -106 个分子

PCR 引物 20 pmol / L

Taq DNA 聚合酶2U

dNTP 50 μmol / L

PCR 缓冲液

将20毫摩尔每升的Tris-HCl缓冲液调整至pH值为8.3。

1.5 mmol /L

25 mmol /L KCl

100μL 灭菌明胶或无核酸酶的牛血清白蛋白

等体积石腊油覆盖。

2、乙肝病毒基因的PCR 检测

1 ） 标本处理

PCR 的主要因素

1、模板DNA

单链、双链DNA 均可作为PCR 的模板。

DNA 样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。

实验所需的模板量需根据实际情况确定，通常情况下，反应液中的模板量大约在100微升，且含有大约10^5至10^6个目标分子。

PCR 反应时模板变性要充分。

2、PCR 引物

成功设计PCR引物是确保获得高品质PCR产物的关键要素之一。在设计和应用过程中，必须关注以下几个关键步骤：

PCR引物的3'末端序列间不应存在显著的互补性，否则可能造成引物二聚体的形成。

（2）要避免引物分子内序列自互补

引物的熔点温度，即Tm值，其数值受到引物碱基序列的组成和长度的影响；在PCR过程中，所使用的引物的GC与AT比例应与目标DNA模板的相应比例相匹配或稍高。通常情况下，熔点温度应设定在55℃以上。

通常情况下，在PCR产物长度不超过500碱基对时，适宜选取长度为16至18碱基对的引物；而对于PCR产物长度达到或超过5千碱基对的情况，选择约24碱基对的引物是比较合适的。

引物的3'端与模板序列需完全匹配，而5'端则相对宽松，允许一定程度的灵活性。

设计的引物需经计算机软件进行详尽分析，包括对引物二聚体的生成、自身互补性以及特异性的评估。

在亚克隆过程中，常用的引物通常会在其5'端引入限制性内切核酸酶的识别位点。为了确保内切酶能够准确切割扩增得到的产物，通常在酶切位点的5'端额外添加数个碱基。

3、热稳定DNA 聚合酶（如Taq DNA 聚合酶）

通常情况下，所需酶量为每100微升溶液中加入2.5单位。若酶量超过此标准，则可能引发非特异性产物的生成。

该酶在75℃时活性最佳，即便在较低温度下，其活性也相当显著。然而，这种酶容易导致引物与模板的不完全匹配，进而引发非特异性的延伸反应，以及引物二聚体的扩增。因此，在实验过程中，我们必须注意避免非特异性产物的生成。

4 、dNTP

PCR实验中常用的四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的浓度范围通常在50至200微摩尔每升之间，具体的最佳浓度需根据实验条件来决定。

5 、PCR 缓冲液

由于在PCR反应过程中，dNTP可以与Mg2+结合，这会改变反应混合物中游离Mg2+的浓度，因此需要根据具体条件来决定适宜的Mg2+浓度。通常情况下，在标准PCR反应条件下（dNTP的浓度为200μmol/L），Mg2+的浓度大约为1./L。

6 、PCR 循环的温度

变性过程需延长起始时间，确保变性彻底，通常在94摄氏度下持续3至5分钟。若变性不彻底，DNA双链将迅速重新结合，进而干扰PCR反应。然而，若温度过高（不宜超过95摄氏度），则可能损害Taq酶的活性。

变性：一般为94 ℃ 30s 或95 ℃ 20s 。

引物退火温度的设定需依据反应中引物与模板的碱基配对情况以及实验目标来决定，通常范围在50至72摄氏度之间。提高退火温度有助于识别不正确的退火引物，同时还能减少引物3'端发生错误核苷酸延伸的可能性。

扩增过程通常设定在72摄氏度，持续时间为60至90秒。在完成最后一个循环后，需在72摄氏度下继续保持5分钟，这样做是为了确保PCR产物的合成能够完整进行。

7 、平台效应和PCR 循环的次数

在PCR反应的后期阶段，随着生成物的累积，原本以指数形式上升的产物曲线会转变为平直状态，这就是所谓的平台效应。这一现象的产生，是多方面原因共同作用的结果，包括PCR原料的逐渐耗尽、酶活性的下降、终产物积累的阻碍作用以及非特异性产物的生成等。因此，我们需要合理地设定循环次数，以确保既能获得充足的PCR产物，又避免无谓地增加循环次数。

8、操作环境

为了防止环境受到污染以及交叉污染现象的发生，需特别注意避免诸如核酸酶污染、非目标DNA污染等问题。