一、实验原理

聚合酶链反应技术是一种在实验室环境中进行的，通过引物引导的DNA扩增过程。该技术的核心原理是在含有模板DNA、特定的PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸（）以及适宜浓度的镁离子（Mg2+）的环境中，借助DNA聚合酶在体外进行的酶促合成反应。在这个过程中，两个引物分别定位在目标DNA序列的两端，与模板DNA的3'端形成互补配对，从而精确地界定出扩增的DNA片段。PCR反应是通过变性、退火和延伸三个步骤的反复循环来实现的，具体来说，就是先将模板DNA在高温下解开双链，接着在较低温度下与过量的引物结合，最后在适宜的温度下由DNA聚合酶推动链的延伸。按照理论计算，经过N次这样的循环，目标DNA片段可以扩增至2的N次方减1倍。然而，由于实际扩增效率并非100%，因此一般需要25至30次循环，才能达到大约10的6次方倍，这样的扩增程度足以支持后续实验的进行。

二、实验材料

表1 实验材料

该设备名称源自PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、BIO-RAD（mini 3 cell）凝胶成像仪，以及电泳级琼脂糖、核酸染料和PCR引物，由杭州擎科提供。

三、实验方法

取来无菌的Ep管，向其中加入表2所列的试剂，构建一个20μL的反应体系，然后离心5秒钟以确保充分混合，注意市售的2×PCR Mix已经包含了dNTP、Mg2+和DNA聚合酶，因此无需额外添加。

表2 PCR体系

体系总体积为2微升，其中包含0.510微摩尔/升的正向引物，0.5微摩尔/升的反向引物，7微升的无菌水和2微升的模板。

根据表3中列出的扩增条件，对PCR仪的参数进行设定，其中引物Tm值决定了最适宜的退火温度，此温度也可直接设定为55℃，而循环过程中的延伸时间需依据目标基因的长度和DNA聚合酶的特性来决定，通常情况下，每分钟延伸1000个碱基对。

表3 PCR体系和条件

温度设定为95℃，时间为5分钟，30秒；或者55℃，时间待定，30秒；再或者72℃，时间待定；接下来，温度降至72℃，持续10分钟；最后，温度降至4℃，保持至无限期。

提取5微升的扩增片段，通过1%琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，以观察反应生成的产物及其长度。

四、常见问题分析与解决方法

1. 无扩增条带：

若酶发生失活，或者反应体系中未添加酶，那么Taq DNA聚合酶可能因保存或运输不当而失效。在这种情况下，通常可以通过更换新的酶或者使用来自不同来源的酶来达到预期的效果。

模板中存在杂质，尤其是那些经过甲醛固定和石蜡包埋的组织，往往含有甲酸，这会导致DNA发生脱嘌呤现象，进而影响PCR实验的结果。

变性温度是否精准：PCR仪器显示的温度是否与实际温度一致，若温度过高，酶在初期循环中会迅速失效；而温度过低，则会导致模板变性不完全。

在反应体系中，若存在蛋白酶和核酸酶的污染，需在添加Taq酶之前，对整个体系进行95℃的高温处理，持续5至10分钟。

引物可能已经变质或者不再有效。我们需要检查人工合成的引物是否准确无误，是否经过纯化处理，或者是否因为储存条件不适宜而导致其活性丧失。

6) 引物错误。利用检查引物特异性或重新设计引物。

在进行DNA凝胶电泳实验时，需添加阳性对照样本，以此验证实验结果是否受到DNA凝胶质量或PCR反应程序的影响。

2. PCR产物量过少：

退火温度设置不当，因此我们采用每步提升2度的方法来设计梯度PCR反应，以优化退火温度。

2) DNA模板量太少。增加DNA模板量。

3) PCR循环数不足。增加反应循环数。

4) 引物量不足。增加体系中引物含量。

5) 延伸时间太短。以1 kb/min的原则设置延伸时间。

变性时间若过长，将致使DNA聚合酶失去活性，因为DNA模板中存在抑制剂。因此，必须保证DNA模板的清洁。

3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

1) 酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

2) dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

3) 浓度过高。可适当降低其用量。

4) 模板量过多。质粒DNA的用量应

5) 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

循环次数频繁；可适当提升模板数量以降低循环次数至三十次，同时缩短退火和延伸阶段的时间，或者考虑采用两种不同温度的PCR循环方式。

7) 退火温度过低。

8) 电泳体系有问题：

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

②凝胶没有凝固好；

③琼脂糖质量差。

9）若为PCR试剂盒则可能：

由于运输储存不当引起试剂盒失效；

试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

4. 扩增产物出现多条带(杂带)

引物的使用量过多，且其特异性不够理想。因此，建议更换引物或者减少引物的使用量。

2) 循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

若酶的添加量过大或是酶的品质欠佳，则需减少酶的用量或寻找其他来源的酶进行替换。

退火温度设定较低，导致退火过程及延伸所需时间较长。建议提升退火温度，以缩短变性和延伸的时长，同时可以考虑使用两种不同温度进行PCR扩增。通过设置2度递增的梯度，对PCR反应的退火温度进行优化。

5) 样品处理不当。

6) Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。

7) 若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

在采用非热启动聚合酶进行操作时，复制过程提前终止的情况较为常见。为了解决这个问题，可以准备冰上反应体系，或者改用热启动聚合酶。

反应缓冲液尚未完全溶解或者混合不均。务必保证反应缓冲液完全溶解且充分搅拌均匀。

10) 引物特异性差。利用检查引物特异性或重新设计引物。

11) 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

12) 模板量过多。质粒DNA的用量应

13) 外源DNA污染。确保操作的洁净。

5. 阴性对照出现条带：

检测用品、操作工具及实验平台存在污染现象。需更换全新试剂及枪头，并对实验平台进行彻底清洁处理。

6. 条带大小与理论不符：

1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。

3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和研究。